Kryokonzervácia Postupy

Kryokonzervácia postupy sú tie, ktoré umožňujú bunky, ktoré majú byť uložené na dobu neurčitú pomocou extrémne nízkych teplôt pozastaviť metabolickej aktivity. Existujú dva hlavné typy kryoprezervačních riadenie: rovnováha (konvenčné pomalé tuhnutie) a nerovnovážnej alebo ultra-rýchle zmrazenie (vitrifikácie). Termín vitrification pochádza z latinského "sklený" alebo sklený. Oba postupy použiť kryoprotektantů s nemrznúcou typu vlastnosti, aby sa zabránilo poškodeniu buniek počas zmrazovania. Akonáhle bunky sa zmrazí alebo vitrifikované, môžu byť uložené do nekonečna ponorením je v tekutom dusíku, extrémne studenej kvapaliny pri teplote -196 ° C (-321 F). Pre obnovenie metabolickej aktivity v bunke po rozmrazení, musia byť odstránené toxické cryoprotectants z bunky a normálne vodnej bilancie postupne obnovená ako bunka sa vráti na normálnu teplotu funkčné. Prehľad
Prehľad
postupy

Kryokonzervácia sú tie, ktoré umožňujú bunky, ktoré majú byť uložené na dobu neurčitú pomocou extrémne nízkych teplôt pozastaviť metabolickej aktivity. Existujú dva hlavné typy kryoprezervačních riadenie: rovnováha (konvenčné pomalé tuhnutie) a nerovnovážnej alebo ultra-rýchle zmrazenie (vitrifikácie). Termín vitrification pochádza z latinského "sklený" alebo sklený. Oba postupy použiť kryoprotektantů s nemrznúcou typu vlastnosti, aby sa zabránilo poškodeniu buniek počas zmrazovania. Akonáhle bunky sa zmrazí alebo vitrifikované, môžu byť uložené do nekonečna ponorením je v tekutom dusíku, extrémne studenej kvapaliny pri teplote -196 ° C (-321 F). Pre obnovenie metabolickej aktivity v bunke po rozmrazení, musia byť odstránené toxické cryoprotectants z bunky a normálne vodnej bilancie postupne obnovená ako bunka sa vráti na normálnu teplotu funkčné.
Cell- špecifické faktory

postup používaný k Cryopreserve bunky alebo tkanivá, závisí na mnohých faktoroch, vrátane veľkosti bunky, bunkové množstvo tekutiny (cytoplazmy) a zložitosti bunky (jedna bunka alebo tkanivo). Bunky s veľkým množstvom cytoplazmy, ako sú vajcia ťažšie Cryopreserve než bunky s len zostatkovou cytoplazme ako spermií. Kryokonzervácia ovariálnej tkaniva je náročné, pretože aspoň tri rôzne typy buniek, rôzne veľkosti sú prítomné v ovariálnej tkanive, z ktorých každý má rôzne optimálnu zamrznutiu potreby. Pomalé zmrazenie protokoly boli s úspechom s rôznymi typmi buniek. Vitrifikácie je v súčasnej dobe najúčinnejšou s jednou bunkou zmrazovania a menej efektívne s tkanivom, ale prebieha výskum pre optimalizáciu vitrification tkanív.
Role kryoprotektantů

Cytoplazma bunka obsahuje vodu, ktorá sa mení na ľadových kryštálov na tuhnutie. Pri tvorbe ľadu vo vnútri bunky, bunka sa kúsky a umiera. Z tohto dôvodu, tekutina v bunke musia byť odstránené pred dosiahnutím teploty pod bodom mrazu, aby nedošlo k poškodeniu buniek. Rôzne druhy tekutín nemrznúca (cryoprotectant) môžu byť použité k dehydratácii bunky pred zmrazením vrátane glycerolu, propándiol, dimetyl-sulfoxde (DMSO), etanol a cukry, ako je sacharóza a trehalóza. Optimálna rýchlosť chladenia (a rozmrazovanie), závisí od typu použitého cryoprotectant a na charakteristike bunky alebo tkanivá, ktorá má byť (alebo to bolo) zmrazená. Cryoprotectants sú toxické pre metabolizmus buniek, takže bunky expozície kryoprotektantů v teplejších metabolických teplotách musia byť minimalizované, alebo radšej. Pri rozmrazovaní alebo ohrievaní bunky, musí cryoprotectants byť kompletne odstránený z bunky pred metabolická aktivita sa obnoví.
Equilibrium Versus nerovnovážných kryokonzervácia poriadku

rýchlosť zmrazovania závisí na tom, či zmrazenie protokol je rovnováha alebo non-equilbrium báze. Pre riadenie rovnováhy typu, je optimálna rýchlosť zmrazenie dosiahnutý, ak existuje rovnováha medzi mierou u ktorého bunka je dehydratovaná vody a miera, v ktorej voda mimo bunky je transformovaný na ľadovú fázu. Táto rovnováha alebo pomaly-freeze protokoly zvyčajne trvať niekoľko hodín dokončiť a počítač používa na spustenie programovateľná rýchlosť mraznička, aby sa zmrazenie sadzby sú presne podľa potreby. Je typicky "hold" krok protokolu u začiatku, aby ručné vytvorenie spúšťače ľadových kryštálov alebo "náletových" v tekutine mimo buniek.

Zosklovateľnení úplne odlišný prístup k zmrazenie, že nespolieha na rampách a dosiahnutie rovnováhy medzi dehydratácie a ľadových kryštálov sa používa. Vitrifikácie je tak veľmi rýchla, že nie je dostatok času na ľade a bunková tekutina je prevedený priamo do sklovca alebo sklenej fázy, aby nedošlo k poškodeniu buniek. Programovateľná rýchlosť mrazničky nie sú nutné, pretože bunka je priamo ponorila do veľmi chladného kvapalného dusíka, na dosiahnutie okamžitej skleného stavu.
Slow-Freeze Postup

Prvým krokom pomalé zmrazenie postup je vystaviť bunky ochrannom v postupnom postupným spôsobom pomaly umožniť určenie rovnováhy bunky sa v ochrannom pri uvoľnení vody. Potom, čo bunky boli vymazané väčšiny buniek vody, sú bunky v ochrannom kvapaliny umiestnené do nádoby z nejakom druhu, ako plastického vlákna, sklenené ampulky alebo plastové vial.The objem kvapaliny v okolí bunky pre pomalé zmrazenia je zvyčajne nižšia ako lyžičkou a môže byť len niekoľko kvapiek. Pre-označený kontajner je naplnený, uzavretý a dať do mrazničky, programovateľný, ktoré sa pomaly znižuje teplotu v kontajneri po dobu niekoľkých minút alebo hodín, veľmi nízke teploty. Po niekoľkých minútach chladenia, musí štartér ľadové kryštáliky sa tvoria vo vnútri kontajnera "naočkované" kontajner. Siatie sa vykonáva pomocou nástroja (napr. kliešte), ktoré boli vopred chladiť v tekutom dusíku na dotyk nádobu a spôsobiť ľadových kryštálov. Táto štartovacie kryštál začne riadené ľadových kryštálov na jednom mieste, v bezpečnej vzdialenosti od buniek. Akonáhle siatie je kompletný, zvyšok sa do chladiacich rampy pokračovať. Keď je nádoba dosiahne teplotu medzi -30 a -85 C, môže kontajner obsahujúci bunky sa vrhol priamo do tekutého dusíka dokončiť chladenie na -196 ° C.
vitrifikácie

Ultra-rýchly nerovnovážne chladenie postupy, ako vitrifikácie použiť vyššia koncentrácia kryoprotektantů spolu s takmer okamžité zmrazenie miery rastu buniek ponoriť priamo do tekutého dusíka. Vitrifikácie obchádza ľadom kryštálu fázy a presunie vodu priamo do skla ako fázy. Vitrifikácie dosahuje rovnaký koncový bod ako pomalé zmrazovanie, ale v pomere -3000C/min, v porovnaní s 10C/min alebo viac. Pre vitrifikácie, bunky sú zvyčajne umiestnené na špičke slamy a prebytok ochrannom je odstránený, takže len toľko, že bunka lipnú na kontajneri povrchového napätia, pred vrhať do tekutého dusíka. Vzhľadom k tomu, zmrazenie je tak rýchly, doba expozície kryoprotektantů je oveľa menšie, a oveľa vyššia koncentrácia kryoprotektantů možno tolerovať bunkou. Otepľovanie bunky vrátiť do normálneho metabolizmu fungovanie musí byť neuveriteľne rýchly. Manipulácia glazované vzoriek je oveľa náročnejšie, než pomaly zmrazených vzoriek, pretože aj krátka expozícia nad teplotu kvapalného dusíka, ktorý môže začať neplánované otepľovanie proces a zmrazenie, čo je škodlivé pre bunky.